LÄHDE: Sandberg Malin
Calcium Dynamics and Vesicle-Release Proteins in a Prion-Infected Neuronal Cell Line (Karolinska Institutet, Stockholm 2005)
Abstraktin suomennosta
“Prionipartikkeli, Prp(sc) on infektiöösi, epämuotoinen luhistunut solun prioniproteiini PrP( c) jota ilmenee keskushermostossa suuria pitoisuuksia. PRIONIT aiheuttavat neurodegeneratiivisia tauteja, joiden kliinisinä oireina on dementia, ataksiaa ja myoklonusta. Nämä taudit aiheuttavat tyypillisiä EEG-muutoksia. Neuropatologiset muutokset ovat aivojen spongiforminen (hohkasienimäinen) degeneraatio, astroglioosi ja neuronien tuhoutuminen. Immunohistokemiallisesti voidaan todeta presynaptisten proteiinien katoamista. Näitä ovat SNAP-25, syntaxiini I, synaptofysiini ja synapsiini I. Tämän väitöskirjan tarkoituksena on luonnehtia sellaisten neurotransmissioon osallistuvein komponenttien muutoksia, joilla saattaisi olla patogeneettistä merkitystä prionisairauksien aivodysfunktiossa. Tutkimuksessa käytettiin hiireen sopeutuneelle scrapie-kannalle alttiita gonadotropiineja erittäviä neuronaalisia solulinjoja (GT1-1). Tällaisissa soluisssa on jännitteestä riippuvia jonikanavia (VDCC) ja paljon proteiineja, jotka osallistuvat säädeltyyn exosytoosiin. (I) Ensinnäkin havaittiin, että scrapie-infektoituneissa soluissa oli N-tyyppisten kalsiumkanavien (VDCC-N) kalsiumvirrat alentuneet kun taas VDCC-L kanavat eivät olleet vaikuttuneet.( Fluorometrinen kalsiumin mittaustekniikka ja patch clamp tekniikka). N-tyypin kanavan alfa1b alayksikön expressio ei ollut kuitenkaan muuttunut, joten syy ei ollut kanavaproteiinissa. (II) Toiseksi havaittiin exosytoosivaiheessa alentuneita proteiinikompleksimuodostumia, esim seuraavien suhteen: SNAP-25, syntaxin 1 A ja synaptofysiini( Western blotting). Näiden proteiinien kompleksisen muodon väheneminen johti lisääntyneisiin monomeerisiin SNAP-25, syntaxiini- 1A ja synaptofysiiniproteiineihin, mikä saattoi korreloida PrP(sc) pitoisuuksiin. Kun kompleksin muodostus oli estetty altistamalla näitä skrapie-infektoituneita GT1-1 soluja lämmölle, saatettiin todeta niissä em. monomeerien alentunut expressio (vähemmän monomeereja). Vertailuja tehtiin infektoitumattomiin kontrollisoluihin. Quinacrine, joka voi puhdistaa pois soluviljelmistä skrapie-infektion, puhdisti näistä ScGT1-1 soluista PrP(Sc) proteiinin ja tuotti ainakin osittaista korjaantumista N-tyyppisten kalsiumkanavien virtauksen ja SNAP-25 ja synaptofysiinimonomeerien pitoisuuksiin. (III) Lopuksi havaittiin , että redusoidun kompleksin muodostuminen ScGT1-1 soluissa ei aiheutunut solujen lisääntyneestä ärtyvyydestä. Sensijaan havaittiin, että pitkäaikainen depolarisaatio nostaa redusoidun kompleksin muodostumista.
Johtopäätöksenä sanotaan, etä prioni-infektio voi aiheuttaa funktionaalisia muutoksia neuronien presynaptisissa komponenteissa ja mahdollisesti elektrokemiallissessa transmissiossa, mkä osaltaan vaikuttaa prionitaudeissa aivojen dysfunktiota. Lopuksi huomautetaan terapeuttisen strategioitten suhteen tärkeä seikka: että muutokset olivat reversibeleitä, palautuvia.
Väitöskirjan taustateoriasta. Terminologiasta.
- Proteiini ja geeni.
PRIONI on proteiininkaltainen infektoiva partikkeli, joka on resistentti sellaisilla keinoilla, suoritetulle inaktivaatiolle, joilla yleensä voi modifioida nukleiinihappoja.
PRIONI on proteaasiresistentti polypeptidi, PrP 27-30. Se on ydinrakenne epänormaalille luhistuneelle proteiinille PrP(sc). Kun tätä luhistumaa seliteltiin mikrsoekvenssejä myöten, selveni, että sitä vastaa geeni PrP, jonka tulisi koodata solun normaalia prioniproteiinia PrP(C) .
Edellytys luhistumaproteiinin PrP(Sc) muodostukselle on että muodostuu PrP (C) normaaliproteiinia ensin. Jos koe-eläin, joka on poistogeeninen (KO) saa PrP(Sc) materiaalia, se ei sairastu tähän tautiin eikä se pysty replikoimaan prionipartikkeleita. Joten PrP(Sc ) on yksinkertaisesti normaalin soluproteiinin PrP(C) vakava luhistuma ja isoformi. (Siis mahdollisesti taustalla ei ole genomiluhistuma, vaan tuote on luhistunut) . Vaikka on kertyvää tietoa näistä PrP (C ) ja PrP (S c) proteiinien biofysikaalisista ominaisuuksista , niin sitä mekanismia, millä tämä infektoiva partikkeli aiheuttaa aivosairauksia, ei oltu vielä pystytty selvittämään. Tutkija haluaakin osaltaan väitöstyössään katsoa, mikä osuus jonikanavilla ja synaptisia rakkuloita vapauttavilla proteiineilla voisi olla prioni-infektioitten aiheuttaman aivodysfunktion patogeneesissa.
Prioniproteiini ja aivojen dysfunktio (aivojen vikatoiminta)
PrP-geeni kuuluu Prn-geeniperheeseen. Prioniproteiini on konservoitua proteiinijoukkoa kautta mammalia-lajien. Koko open reading frame (ORF) sijaitsee yhdessä exonissa, joten ei ole mahdollisuutta vaihtoehtoiselle RNA-pilkkoutumiselle (alternative RNA splicing). On konstitutiivista , että aikuisen eläimen aivoissa esiintyy PrP(C )mRNA, mutta sen expressio on tarkasti säätynyttä kehityksen aikana.
MITEN PRIONI MUODOSTUU? Miten voi PrP(C) lähteä luhistumaan sellaiseksi, että proteaasitkaan eivät pure siihen? Tästä tutkija on kiinnostunut. Normaalin PrP (C) proteiinin synteesistä
ERr ja Golgin laite. Proteiini syntetisoituu karkeassa endoplasmisessa retikulumissa (roughER) ja modifioituu usealla posttranslationaalisella muutoksella kuten glykosylaatiolla, disulfidisiltojen muodostumisella ja glykosyylifosfatidyyli-inositoli (GPI-)-ankkurin liittämisellä kulkiessaan Golgin laitteen läpi kohti plasmamembraania.
GPI-funktio: GPI yksikkö suuntaa PrP(C)-proteiinin plasmakalvon lipidilevyyn ( lipidraft).
Lipidilevy ja endosyyttinen sykli. Lipidilevystä käsin peptidi sitten omaa syklin takaisin endosyyttisiin osastoihin ja altistuu proteolyyttiseen pilkkoutumiseen.
PrP(C) molekyylin kinetiikka, Kestää 60 minuuttia normaalisti, kun PrP (C) kulkeutuu täten solun kautta.
PrP (C) sitoo kuparia (Cu). Normaali prioniproteiini sitoo kuparia, Cu-joneja, matalalla mikromolaariseslla affiniteetilla aminoterminaalisen oktapeptidin toistuvien jaksojen avulla pH-herkässä prosessissa.
Useita topologisia muotoja on havaittavissa PrP (C) molekyylissä. Yksi muoto (CtmPrP ) ER-kalvosmembraanissa asettuu niin, että C-terminaalinen pää on lumeniin päin. Eräs toinen muoto ( NtmPrP) asettuu siten, että ER-lumeniin päin on N-terminaali.
CtmPrP-muoto on herättänyt kiinnostusta, koska siirtogeenisille koe-eläimille kehittyy neurodegeneratiivinen tauti, joka muistuttaa prionitauteja.
Lisäksi yhdessä tapauksessa perinnöllisiä ihmisen GSS-variantteja on myös todettu CtmPrP Tämä on Gerstman-Sträussler-Scheinker-tauti (GSS). Kuitenkaan ei saada kokeellisesti hiiressä tai hamsterissa esiintymään sellaista scrapietautia, jossa esiintyisi CtmPrP.
PrP( C) proteiinin merkityksestä. Pitääkö sitä olla?
PrP (0/0) eivät osoittaneet mitään ilmeistä muutosta kehityksessään tai käytöksessään, kun PrP(C) puuttuu, mutta PrP(0/0) koe-eläinhiirillä havaittiin cirkadisen rytmin ja unen häiriöitä ja neuronit olivat altiimpia oksidatiiviselle stressille kuin wild type (wt) -koe-eläimillä. Normaali PrP(C) rakenne on 3 % beeta-struktuureita ja 40 % alfa-helix-struktuureita sisältävä. Detergenteillä uutettuna PrP (C) on liukeneva.
PrP(C ) liittyy membraanin GPI-ankkuriin, joka on proteaasisensitiivinen.
PrP(sc) proteiiniin liittyvä prionitauti, scrapies
PrP( Sc) on isoformi, joka muodostuu toistaiseksi tuntemattomalla posttranslationaalisella tavalla. PrP(Sc) rakenteessa havaitaan on 45 % beeta-struktuureita ja 30 % alfa helix- struktuureita. PrP(Sc) sisältää proteaasiresistentin ytimen PrP 27-30. Detergenteillä uutettuna PrP(Sc) muodostaa sauvanmuotoisia makromolekyläärisiä aggregaatteja. Lisäksi PrP(Sc) liittyy kalvon GPI-ankkuriin, joka muuttuu resistentiksi fosfatidyyli-inositolispesifiselle entsyymille (PIPLC), joten voidaan havaita eroja normaalin PrP ja PrP(Sc) kalvotopologiassa.
Miten epänormaalia PrP(Sc) muodostuu?
Täytyy olla olemassa normaalia proteiinia PrP(C), joka sitten suoraan muuttuu muotoon PrP(Sc). Konversioon vaaditaan suora interaktio näiden muotojen kesken. Tätä prosessia pääsee tapahtumaan lipidilevyssä, raft alueissa tai caveolan kaltaisissa alueissa. Tai varhaisessa endosomissa.
Mikä estää PrP(Sc) luhistumaproteiinin muodostusta?
Kun normaali PrP (C) suuntautuu clatriinipäällysteisiin kuoppiin, estyy PrP(Sc)-muodostus.
Uusimpia tietoja PrP(Sc) rakenteesta
PrP(Sc) saattanee olla ” vasenkätinen” beeta-helix-rakenne.
Rekombinoitua koe-eläimen prioniproteiinia voidaan polymerisoida ja siitä tulee amyloidifibrillejä, jotka inokuloitaessa aivoon aiheuttavat transgeenisellä koe-eläimellä neurologisen dysfunktion. Lisäksi, jos extraktia inokuloidusta koe-eläimestä ruiskutettiin wt- terveeseen koe-eläimeen, tauti tarttui, osoittaen, että prioni voi syntetisoitua kehon ulkopuolella ex vivo.
PrP(C) proteiinin glykosylaatioasteeen variaatioitten on katsottu myös vaikuttavan siihen tahtiin, millä normaalirakenne PrP(C) muuntuu prionirakeneeksi PrP(Sc).ja PrP(SC- glykoformien suhde vaihtelee eri PrP(Sc) kantojen kesken.
Proteinaasi K-herkkä prioniproteiini (sPrP)
On löydetty infektoituneitten jyrsijöiten verestä proteinaasiK-herkkää prioniproteiinia sPrP. Konformaatiosta riippuvaa immuunimenetelmää käytettiin. Mitattiin samanaikainen denaturoituneen ja natiivi-PrP-proteiinin määrä. Prionimolekyylin malli on saatavissa netistä osoitteesta www.cmpharm.ucsf.edu/cohen
Prionitaudit ovat
Creuzfeldt- Jakobin tauti (CJD), sporadinen, familiaarinen ja jatrogeeninen
Gerstman-Sträussler-Scheinkerin tauti GSS)
Fataali familiäärinen insomnia (FFI)
Naudan spongiforminen enkefalopatia (BSE) ja siihen liittyneenä
vCJD, variantti Creuzfeldt-jakobin tauti
Krooninen kuihtumistauti (Chronic Wasting Disease CWD)
Lampaiden ja vuohien tauti scrapie.
Miltei kadonnut tauti kuru, jota seurasi kannibalismista.
Aivojen patologiset muutokset prionitaudissa
Tähän kuuluu spongiforminen neuronidegeneraatio, astroglioosi ja joskus amyloidifibrillien saostumaa. Spongiformista (hohkaista) muutosta luonnehtii vakuolirakkulat neuropiilirakenteissa. Vakuolit loklisoituvat hermon jatkeosiin kalvoihin. Vakuolien sisällä on pirstoutunutta kalvomateriaalia dendriittien ulokkeissa ja jonkin verran aksoniulokkeessakin. CJD-potilaalla dendriittiulokkeitten laajentumat olivat suhteettomasti suurempia kuin se tilavuus, jossa oli vakuoleja. Aivojen pyramidaalisia ja nonpyramidaalisia neuroneita tutkittaessa dendriitien hahmo olli epätarkempaa, ulokkeet harvempia ja paikallista turvotusta oli havaittavissa. Scrapiehamsterilla oli samaan tapaan spongiformia muutosta ja vakuolisaatiota ja Golgivärjäyksesä kortikaaliset neuronit olivat ohuempia, dendriitit lyhyempia ja turvonneita.
Aksoniterminaalin muutos prioni-infektiossa
Aksoniterminaalin muutokset tapahtuvat hiiressä varhain scrapie-infektiossa, samoin ihmisellä CJD-infektiossa. Yleinen presynaptisten, exosytoosiin osallistuvien proteiinien vähenemä tapahtui. Näitä proteiineja olivat SYNAPTOFYSIINI ( pienissä synaptisissa rakkuloissa; synapsin merkkinä käyetty), SYNAPSIINI-1, SNAP-25, SYNTAXIINI-1.
Presynaptisilla proteiineilla on osuutta jännitteesta riippuvien N-.tyyppisten kalsiumkanavien ja P/Q-tyyppisten kalsiumkanavien säätelyssä. GTI-1 soluissa on N-tyyppisiä kalsiumkanavia.
Ovatko muutokset presynaptisissa proteiineissa sekundäärisiä neuronin kuolemalle vai ei? Ainakin eräissä tutkimuksissa on osoitettu, että neuronikadolle paralleelisti vähenee näitä proteiineja em. prionitaudeissa. On toisenlaistakin tulosta ollut. Lisäksi on joissain tutkimuksissa havaittu epäjärjestystä ja synapsikatoa aksoniterminaalissa CJD-taudissa ilman itse neuronin katoamista. PrP(Sc) näyttää ko-lokalisoituvan siihen, mihin SYNAPTOFYSIINI asettuu CJD-taudissa. Lisäksi PrP(Sc) akkumuloituu thalamuksen ja neocortexin synaptosomeihin scrapie-hiiressä. Aksonaalisia muutoksia voi kuitenkin tapahtua niilläkin alueilla, missä on hyvin vähän PrP(Sc)-proteiinia. Monet tutkimukset raportoivat aksonien terminaalisista muuntumisista, mutta on edelleen epäselvää, miten nämä muutokset suhtautuvat prionitautia sairastavien dysfunktioihin.
PrP(C) ja PrP(Sc) ja elektrofysiologisest muutokset
Huomattava elektrofysiologinen muutos sporadisessa CJD-taudissa (sCJD) on EEG-muutoksena eri kortikaalisilla alueilla havaitut teräväaaltoiset periodiset kompleksit. Nämä EEG-muutokset muistuttavat interiktaalisia epileptogeenisiä purkauksia ja edeltävät tai esiintyvät samaan aikaan kuin myoklooniset kouristukset. Samantapaista löytöä on saatu scrapie-infektoituneista lampaista ja rotista. Taustana on alentunut synaptinen inhibitio. Terminaalisesti todettiin pitkittyneitä aktiopotentiaaleja ja alentunut AHP (fast afterhyperpolarization) CA1- pyramidaalisoluissa. Edellinen löytö hävisi kun käytettiin jännitteestä riippuvien kalsiumkanavian estäjiä. Scrapie- hiirellä ja -hamsterilla osoitettiin CA1 pyramidaalisolujen hyperexcitabiliteetti elektrofysiologisissa tutkimuksissa. LTP-muodostus ( muistiaines) katosi CA1-alueesta.Jne.
Tutkittaessa, onko syynä PrP(C) alentuma vai PrP(Sc) vaikutus, käytettiin Prp(0/0) koe-eläimiä.
PrP(0/0)
Hippocampuksen CA1 alueella oli hyperexcitabiliteettiä. GABA-A välitteinen nopea inhibitio oli heikentynyt. LTP-muodostus oli myös heikompi. Annoksesta riippuvan excitatorisen synaptisen transmission stimulaatio näyttää olevan korrelaatiossa PrP(C) proteiinin exspressioon, mikä osoittaisi PrP(C) proteiinin omaavan modulatorista osuutta neuronaalisessa excitaatiossa. Kuitenkaan muut elektrofysiologiset tutkimukset hippokampaalisesta CA1 alueesta Prp(0/0) koe-eläimellä ei osoittanut sellaisia muutoksia. Toisaalta PrP(0/0) hiireltä on CA1 pyramidaalisista soluista ja cerebellaarisissa Purkinjen soluista todettu madaltunut myöhä AHP.On myös tuotettu poistogeenistä PrP- hiirtä tutkittaessa PrP:n vähentymän vaikutusta aikuisen aivon funktioon ja neuronin elossapysymiseen. Näissä eläimissä oli huomattava AHP-alenema, joka edelleen korosti PrP(C) proteiinin moduloivaa merkitystä neuronaalisessa stimuloitumisesa. Redusoituneen PrP(0/0) määrä koe-eläimessä korjaantui ihmisen PrPK200-exspressiosta. Tätä samaa entsyymiä havaitaan periytyvissä prionitaudeissa, joten voidaan päätellä, että muutos on seurausta PrP(c) menetyksestä. PrP ( conditionally knock out mice) poistogeeninen hiiri pysyi terveenä osoittamatta neurodegeneraatiota, kun PrP oli poistettu. Jos taas aikuisen neuronaalinen PrP poistettiin infektoituneelta koe-eläimeltä, ei kehittynyt prionitautia, vaan se estyi ja spongiformiset muutokset olivat reversibeleitä.
Prioniproteiinipeptidien toksisuus
Toksisuustutkimuksissa katsottiin PrP(Sc) suoria vaikutuksia neuroniin isoloimalla amyloidiplakkikomponentteja. GSS on sellainen perinnöllinen neurodegeneratiivinen prionitauti, jossa PrP amyloidia suurin määrin saostuu keskushermostoon (CNS). Kun tällaista amyloidiplakkiydintä tarkemmin tutkittiin, siitä löydettiin päätuotteena 11 kD pilkkoutunut PrP ( spanning residues) 58- 150 Tämä degradaatiotuote korreloi siihen kohtaan, mistä voi muodostua beeta-helixiä ja amyloidia ja se on osittain resistentti proteolyysille. Jos tälle PrP-fragmentin segmentille tehdään homologisia synteettisiä peptidejä, ne muodostavat koeputkessa fibrillejä. Nämä fibrillit taas muistuttavat niitä fibrillejä, joita GSS-aivoissa muodostuu (PrP 106-121) sekä scrapie-tautiin liittyviä firillejä (PrP 127-147). Neuronaalista apoptoottista kuolemaa tapahtuu, jos pitkän aikaa applikoidaan vahvasti fibrillogeenisiä peptidejä hippokampaalisiin ja pikkuaivojen granulaarisiin soluviljelmiin. Neuronaalisen solukuoleman välittäjänä lie osittain mikrogliavaste, koska kahden eri solutyypin samanaikaisviljely lisää peptiditoksisuutta. PrP 106-121- fragmentti välittää astrogliaalista proliferaatiota. Ja tätä proliferaatiota voi estää L-tyyppisten kalsiumkanavien blokeeraajilla. Työssä käytettyjen GTI-1-solujen akuutti altistus PrP106-121-peptidille lisäsi sytosolin vapaata kalsiumia (Ca++). Pitkäaikainen altistus pikkuaivojen granulaaristen neuronien viljelmässä tai neuroektodermaalisessa GH3-solulinjassa aiheutti jännitteestä riippuvien L-tyyppisten kalsiumkanavien kalsiumvirtojen aktiviteetin laskua Altistus tälle samaiselle fragmentille vähensi N-tyyppisten kalsiumkanavien kalsiumvirtoja PC12-soluissa, mutta L-tyyppiset kanavat eivät vaikuttuneet. Lopuksi: PrP(C) rekombinantti, täyspitkänä, lisättynä pikkuaivojen granulaarisiin soluihin aiheutti alentuneita kalsiumvirtoja jännitteestä riippuvissa L-tyypin kalsimkanavissa. (VDCC-L). Tämä vaikutus riippuu PrP(C)-proteiinin kuparia sitovasta N-terminaalisesta osasta. Kaiken kaikkiaan havaitaan että PrP peptidi voi aiheuttaa häiriöitä kalsiumkanavissa. Kuitenkin PrP-fragmenttien lisääminen muistuttaa PrP(Sc): n extrasellulaarisia vaikutuksia neuronaaliseen soluun ennemminkin kuin infektoituneen solun intrasellulaarisia tapahtumia. Sen takia neuronaalisten solujen jännitteestä riippuvien kalsiumkanavien (VDCC) tutkimuksesta saataneen informatiivista tietoa.
VDCC-kanavien ryhmä
Näitä kanavia alettiin löytää lihaksia tutkittaesa ja havaittiin, että aktiopotentiaalin indusoijana ei ollutkaan natrium vaan kalsium (1953). Näitä kalsiumkanavia on kehossa yleisesti ja ne ovat elektrogeenisiä ja regulatorisia. Intrasellulaarinen vapaa kalsium on tasoja 30 nM- 200 nM. Tätä homeostaasia pitää yllä ATP:stä riippuvainen kalsiumpumppu ja Na+-Ca++ vaihtojärjestelmä. Matala intrasellulaarinen pitoisuus varmistaa tehokkaat nopeat vasteet erilaisille biologisille prosesseille supistuksell ( contraction) , eritykselle ( secretion) ja kanavatoiminnalle ( gating).
VDCC yleisrakenne
5 alayksikköä, transmembraani alfa1 ja sillä on 10 alayksikköä. Ca v.
Intrasellulaarinen alayksikkö beeta
Disulfidilinkkiytynyt dimeeri, joka on liittynyt alfa1-kanssa ( alfa1 delta)
Transmembraaninen alayksikkö gamma
VDCC kanavien nimeäminen
LVA, low voltage activated (Cav 3.1.-3.3.)
T-tyypin kalsiumkanavat. Nämä inaktivoituvat nopeasti depolarisaatiota ylläpitävissä potentiaaleissa. Johtavuus on vähäinen ( ”tiny”, tästä nimi T-kanava)..
HVA, high voltage activated
Eivät inaktivoidu niin nopeasti kuin edellinen. Kolme alaryhmää.
- L-tyypin kanavat (Cav1.1-1.4). Pitkävaikutuksinen , large single channel conductance, dihydropyridiini- sensitiivinen. Pääasiassa esiintyy mm lihaksissa: Sydänlihas, muu lihas, sileä lihas. Endokriiniset sekretoriset solut. Pitkä tai stabiili depolarisaatio. Geeniexspressiossa toimiva Ca++-kanava. Proksimaalisessa dendriitissä tai neuronin soomassa. Aiheuttaa hidasta ja sitkeää kalsiumvirtaa. (Nifedipiini ja nimodipiini isoloi tätä kanavaa).
- Välimuotoinen kanava N (Cav2.2) ja P/Q (Ca v2.1) tyyppien kalsiumkanavat( eräille toksiineille sensitiivisiä). Pääasialliset kanavat CNS:n presynaptisten rakkuloiden vapautumisessa ja hermosignaalin transmissiossa. Pääasiassa esiintyy cortexissa, hippocampuksessa, thalamuksessa, basaaliganglioissa, Purkinjen soluissa ja hypothalamuksen takalohkossa. Nopea inaktivaatio. Neurotransmitterivälitteinen inhibitio vaikuttaa näihin presynaptisiin kalsiumkanaviin ja on G-proteiiniin liittynyt ja G-beetagamma alayksikkö muuttaa gating-ominaisuuksia: ”Voltage dependent inhibition” Yksi aktiopotentiaali inhiboi vahvasti synapsia. Mutta aktiopotentiaalien virta poistaa inhibition. Näisä kanavissa on ”synprint”-kohta: synaptisten proteiinien interaktiokohta. Sillä on merkitystä kalsiumkanavan modulaatiossa ja hienosäädössä.
GABA-vapautumista tapahtuu joko N- tai P/Q-kalsiumkanavien toiminnan välittämänä riippuen synapsia modostavan interneuronin sijainnista hippocampuksessa.
Glutamaattireseptorit hippocampuksessa sisältävät ainakin 3 eri tyyppistä kalsiumkanavaa, jotka osallistuvat glutamaatin vapauttamiseen, myös synapseissa, jotka lähtevät yhdestä presynaptisesta neuronista. Hypothalamuksessa N-kalsiumkanavan inhibitio alensi inhibitorista synaptista transmissiota enemmän kuin excitatorista transmissiota. Tästä voi päätellä olevan suhteellisia eroavuuksia kalsium influx-virroissa ja välittäjäaineen vapauttamisissa excitatorisella ja inhibitorisella puolella neuronijärjestelmää.
Esim: Neuroniin tulee inhibitorisia ja excitatorisia säikeitä. Inhibitorisessa voi olla päätteissä vain N jaP/Q tyypin VDCC. Excitatorisssa on 3 eri tyyppiä VDCC. Jos N-kanava säätyy alas hiljenee inhibitorinen neuroni, excitatorinen ei vaikutu. Nettoefektinä lie neuronaalisessa verkossa lisääntynyt excitaatio
- R-tyypinkalsium kanavat (Cav2.3) ovat resisenttejä niille toksiineille, joille ed. ovat herkät.
Neuronin välittäjäainerakkulan vapautumisesta
SYNAPTOFYSIINI
Presynaptinen proteiini, pienissä synaptisissa rakkuloissa; synapsin merkkinä käytetty. Tätä ei esiinny hermoston ulkopuolella paitsi neuroendokriinisissä soluissa. Päätehtävä on tuntematon. Sitä esiintyy runsaasti ja yksimuotoisena synaptisen exosytoosin yhteydessä. Synaptofysiinipoistogeeninen koe-eläin on fenotyypiltään normaali ja neurotransmissio on normaalia. Kuitenkin synaptofysiinivasta-aineet vähentävät välittäjäainetransmissiota. Mahdollinen funktio on osallistua synapsin muodostumiseen. ( Prioniproteiini asettuu tämän proteiinin kohtaan)SYNAPTOFYSIINI on interaktiossa
SYNAPTOBREVIININ (R-SNARE) kanssa
muodostaen kompleksin, josta sulkeutuu ulos muut SNARE-proteiinit ( kuten syntaxiliini ja SNAP-25) Kompleksin SYNAPTOFYSIINI & SYNAPTOBREVIINI-muodostus on riippuvainen korkeasta kolesterolipitoisuudesta rakkuloitten kalvoissa. Neuroendokriinisoluissa tällaista kompleksia ei muodostunut.
SYNAPSIINI-1
SNAP-25a ja SNAP-25b
Synaptosomal associated protein 25 kDa. 25 kDa proteiini, joka on liittynyt synaptosomaalisesti. SNAP-25 osallistuu kahdella alfa-helixketjullaan exosytoottisen SNARE-kompleksin muodostumiseen, jossa on 4 alfa-helixiä. SNAP—perheessä on paljon isoformeja. Neuroneissa ja neuroendokriinisissä soluissa esiintyy SNAP-25a ja SNAP-25b, jotka eroavat vain 9 aminohapon ketjulta, mutta juuri siinä pätkässä on kohta, joka osallistuu subtraattina posttranslationaalisen rasvahapon liittämiseen. Asylaatiossa liitetaan C16:0 , palmitiinihappo. Tämän liittymä sitten määrääkin, minne proteiini hermostossa sijoittuu. Syntaxin 1A-muodostus vaatii Munc-18-1 samanaikaisilmentymää. SNAP-25a liittyy neuriitin kasvuun ja vesikkeleiden fuusioon. SNAP-25b liittyy neuronaaliseen synaptisten vesikkeleitten vapautumiseen ja neuroendokriiniseen eritykseen. Se voi myös stabilisoida rakkula- allasta ja saa aikaan laajempia vesikkelivarastoja. Tosin SNAP-25a voi myös olla mukana vesikkeleiden vapautumisessa.
SYNTAXIINI-1. Membraanifuusion välittäjä.
SYNTAXIINI-perheessä on 15 proteiinia, joista intrasellulaarisiin organelleihin on sijoittuneina syntaksiinit 5-15 ja plasmamembraaniin membranifuusiota vaikuttamaan asettuu syntaxiinit 1-4. SYNTAXIINI 1A esiintyy miltei ainoastaaan neuronissa ja neuroendokriinisissa soluissa . Sillä on intrasellulaarinen kohta. Munc-18-1 interaktiolla syntaxiini kohdistautuu plasmamembraaniin, vaikka osa jäisi intrasellulaarisesti. Munc-18-1 pitää syntaxiinia ”kiinni” siten, että se ei pääse epäsuotuisasti SNARE-komplekseja muodostamaan. Munc-18-1 kiihdyttää syntaksiini 1A liittymiä kolesterolipitoiseen lipidilevyyn (raft).
SNARE- kompleksi ja eksosyyttinen koneisto
(SNAP-receptor), VDCC tyyppi N kalsiumkanavat toimivat yhteistyössä presynaptisessa vesikkeleitten vapauttamisessa. Prionitaudissa presynaptiset proteiinit ovat vähentyneet, joten vesikkelien vapauttamisessa on vaikeuksia.
Kalvofuusio
on avainseikka vesikkelien vapauttamisessa. Membraanifuusio on universaalinen prosessi. Sitä tapahtuu 1. extrasellulaarisesti virusten tunkeutuessa soluun tekemällä isäntäsolun kanssa fuusiota; 2. intrasellulaarisesti, kun erilaiset organellit fusoituvat keskenään tai fusoituvat solukalvoon. Säädelty hermonvälittäjäaineen vapautuminen synapsissa exosytoottisella rakkulalla on nopea tapahtuma, jota kalsium liipaisee esiin alle 1 millisekunnissa. Tästä voisi päätellä, että synaptisen rakkulan fuusion plasmakalvoon on täytynyt olla suureksi osaksi valmisteltua jo ennen kuin stimulus tulee synapsiin ja antaa herätteen. Kaikki intrasellulaarinen fuusio tapahtuu samantapaisella systeemillä, joten on tärkeää, että donorimembraani, luovuttajakalvo ( kuten solun sisäinen kuljetusrakkula) liittyy ja laituroituu sopivaan acceptor membraaniin, vastaanottajakalvoon- (docking) .
Rab GTPaasit
säätelevät tätä laituroitumista toimimalla tunnistavina antenneina ( identity tags).
SNARE-proteiinit ( SNAP-reseptoriproteiinit )
Kun fuusiota aletaan, kokoontuu välittäjäksi iso dynaaminen proteiinikompleksi SNARE ( SNAP-receptor) proteiinit ja Munc 18-1, syntaxiinin kanssa interaktiossa oleva proteiini. Jotta donori proteiini pääsee akseptoriproteiniin lähelle, liittyy SNARE proteiinit molempiin kalvoihin.
vSNARE , t SNARE
Synaptisen kompleksin muodostaa pääasiassa yksi SNARE-proteiini liittyneenä rakkuloihin (SYNAPTOBREVIINI) ja kaksi SNARE-proteiinia liittyy plasmamembraaniin (SYNTAXIINI 1 ja SNAP-25) Tämän takia SNARE-proteiinit nimitetään vSNARE (vesicle) ja tSNARE( target) nimillä. Snare-proteiineja määritellään yhden homologin sekvenssin mukaan Snare-motiivissa on 60-70 aminohappoa, joissa on 8 toistoa. Alaperheitä on neljä Qa- syntaksiinit, Qb ja Qc- ( SNAP-25 ja R-SNARE, (synaptobreviini).
SNARE-proteiinit välittävät funktionaalisen SNARE-kompleksin muodostumisen kerääntymällä spontaanisti pidentyneisiin nelihelix-kimppuihin, joissa nämä neljä eri SNARE-motiivia ovat paralleelisti orientoituneena aina yksi alaperhe proteiineja yhdessä, (kuten Qa, Qb, Qc, R) C-terminaalit näkyen transmembraanisesti.
Jos kokoontuma asettuu vetoketjumaisesti N-terminaalisesta päädystään C-terminaaliseen ankkuriin, erittäin stabiili tarkka transkompleksi muodostuu,j ossa kaksi kalvoa ovat hyvin lähekkäin. Kun kalvot ovat tehneet fuusion, muodostuu cis-kompleksi. Jotta SNARE-proteiinit voisivat kiertää hyödynnykseen, tämän cis-kompleksin on pystyttävä erkanemaan ja siihen tarvitaan ATPaasi. NSF yhdessä ja kofaktoreita NSF-liittymisproteiineja tarvitaan myös (SNAPs). Keskustellaan siitä, osallistuvatko SNARE-poteiinit aktuelliin fuusioon vai onko transitio trans-konfiguraatiosta cis-konfiguratioon se, mikä katalysoi essentielliä, mutta epätäydellistä askelta intrasellulaarisessa fuusiotiessä. SNARE-proteiinien välttämättömyys fuusiossa voi olla pettävääkin, puijausta osittain, eikä vielä tiedetä, missä määrin muut proteiinit ovat essentiellejä kofaktoreita fuusiolle.
Säädelty exosytoosi
Presynaptisella aktiivilla vyöhykkeellä on ainakin kalsiumista riippuva prosessi. Arvellaan, että vapautumista triggeröi kalsiumsensori exosytoosin tapahtumakohdalla.
SYNAPTOTAGMIINI 1
on synaptisen rakkulan proteiini, ison perheen jäsen, josta perheestä moni osallistuu välittäjäaineitten vapautumiseen. Synaptotagmiini1 sitoo multippeleja kalsiumjoneja kahden fosfolipididomaaninsa avulla. Jos toinen domaani ei ole käytössä, kalsiumin exosytoottinen affiniteetti laskee. Mutta miten, sitä ei tiedetä.
Väitöskirjatyön kommentti
Tutkija kohdistuu hyvän taustamateriaalin esitettyään näihin kolmeen proteiiniin SYNTAXIINI A1, SNAP-25 ja SYNAPTOFYSIINI. Näistä mielenkiintoiset SYNTAXIINIA 1 ja SNAP-25 ovat läheisessä interaktiossa presynaptisen alueen VDCC-N kanssa. SYNAPTOFYSIINI liittyy pikkuisiin vesikkeleihin ja vaikuttaa niitten vapautumistiehen. Sitten hän otti selville seuraavia seikkoja tutkien prionilla infektoitunutta GTI-1 solua: (I) Voiko prioni-infektio aiheuttaa muutoksia jännitteestä riippuviin kalsiumkanaviin, erityinen mielenkiintokohdistetaan N-tyypin kanaviin. (II) Määritellään, voiko prioni-infektio vaikuttaa neuronaalisen solun exosytoosin proteiinijoukkoon. (III) Voiko pitkittynyt depolarisaatiotila vaikuttaa kompleksin muodostumiseen proteiineissa, jotka osallistuvat eksosytoosiin.
Abstrakti antaakin sitten hyvät johtopäätökset ja hieman vastausta asiaan, mutta kuitenkaan prionin muodostumisen varsinainen syy ei selviä. Kuvataan lähinnä seurauksia tilanteessa. Jää kuitenkin sellainen käsitys kuin että prioni olisi tuollainen SNARE-kompleksi, jonka pitäisi nopeasti hajota ja osasten hyödyntyä, mutta kompleksi ei hajoa, vaan jää muotoon, jota ei edes proteaasit saa purtua.
Väitöskirjan lisäksi kirjoittajalla on ollut mm. seuraava edeltävä julkaisu.
Scrapie-inected GTI-1 cells show impaired function of voltage-gated N-type calcium channels (Ca v 2.2) which is ameliorated by quinacrine treatments ( 2004).
Oma kommentti: 07/11/2005 22:18
Jossain materiaalissa, joka tuli esiin tehdessäni projektia Vitamini K-alueelta, eräässä abstraktissa mainittiin, että CJD- potilaan aivostossa oli vähiten infektoitunut alue K-vitamiinipitoisinta.
On todennäköistä, että prioniproteiinin kuparipitoisuus vaatii vahvan oksidantti-antioksidanttijärjestelmän, joten vihreitten kasvien ja vihannesten osuus niin ihmisen kuin eläimenkin ravinnossa on ensisijainen seikka taisteltaesa tämän tapaisia proteiiniluhistumia vastaan. K1-vitamiinipitoisuus on lajispesifinen asia ja esim nautakarjalla K1 vitamiinin tarve on huimasti korkeampi kuin mikä on ihmisen K1-vitamiinin tarve. Koska Suomessa on mainittu takavuosina esiintyneen lampaiden scrapiesta, pitää muuntaa sitä vanhaa ajattelutapaa lampaan kasvatuksesta. Että lammas on eläin joka on vaatimaton, ei vaadi oikeastaan mitään- Asia on päinvastoin- se vaatii hyviä vihreitä niittyjä, joiden kunnostamiseen kannattaa panostaa ennen kuin alkaa laajemmin lampaitten hoitoa suunnitella. Lammas ei vain ole pihan biologinen ruohonleikkuri. Ja ihminenkin luotiin alun perin kasvisyöjäksi.
2005-11-07 22:19 
Inga kommentarer:
Skicka en kommentar