Edellytykset hyvälle proteiinin laaduntarkkailulle

Artikkeli vuodelta 1999
http://jcb.rupress.org/content/147/7/1443.full.pdf
Abstract.

Protein disulfide isomerase (PDI) interacts with secretory proteins, irrespective of their thiol content, late during translocation into the ER; thus, PDI may be part of the quality control machinery in the ER.

Proteiinidisulfidi-isomeraasi PDI käy vuorovaikutukseen sekretoristen valkuaisaineitten kanssa riippumatta niiden tiolipitoisuudesta( -SH ryhmistä) , endoplasmiseen retikulumiin
translokoitumisen myöhäisvaiheissa. Täten entsyymi PDI voi olla osa proteiinien laaduntarkkailujärjestelmää.

We used yeast pdi1 mutants with deletions in the putative peptide binding region of the molecule to investigate its role in the recognition of misfolded secretory proteins in the ER and their export to the cytosol for degradation. Our pdi1 deletion mutants are deficient in the export of a misfolded cysteine-free secretory protein across the ER membrane to the cytosol for degradation,
but ER-to-Golgi complex transport of properly folded secretory proteins is only marginally affected.

Tämän artikkelin työ suoritettiin hiivassa pdi1 deleetiomutantilla, joka ei pystynyt kuljettamaan takaisin soluliman puolelle väärin laskostuneita cysteiinittömiä sekretorisia proteiineja. Cys on aminohappo jossa olisi -SH ryhmä. Mutta ER- GOLGI jatkokulkeutuminen normaaleilla proteiineilla oli kuitenkin vielä jokseenkin hyvä.

We demonstrate by chemical cross-linking that PDI specifically interacts with the misfolded secretory protein and that mutant forms of PDI have a lower affinity
for this protein.
Tutkijat osoittivat kemiallisten poikkisidosten avulla, että PDI entsyymi käy spesifiseen interaktioon väärin laskostuneitten sekretoristen proteiinien kanssa ja jos PDI on mutatoitunut sen tehokkuus on alentunutta sellaisia proteiineja kohtaan.

In the ER of the pdi1 mutants, a higher proportion of the misfolded secretory protein remains associated with BiP, and in export-deficient sec61 mutants, the misfolded secretory protein remain bounds to PDI.

Sellaisissa tapauksissa missä oli pdi1 mutantti jäi suurempi osa väärinlaskostuneita sekretorisia proteiineja liittyneeksi BiP:hen. Ja takaisinkuljettamiskyvyltään vajeisen sec61 mutantin tapauksissa väärinlaskostunut sekretorinen proteiini jäi sitoutuneeksi PDI- entsyymiin.

We conclude that the chaperone PDI is part of the quality control machinery in the ER that recognizes terminally misfolded secretory proteins and targets them to the export channel in the ER membrane.

Tästä tiedemiehet tekivät johtopäätöksen, että PDI chaperoni on osa laaduntarkkailukoneistoa endoplasmisessa verkostossa (ER) ja terminaalivaiheessa voi tunnistaa väärinlaskostuneen eriteproteiinin ja kohdistaa sen takaisinkuljetuskanaviin endoplasmisen verkoston(ER) alueelta sytoplasmaan.

Key words: protein disulfide isomerase • endoplasmic
reticulum-associated degradation • endoplasmic reticulum
quality control • BiP • yeast

AVAINSANOJA
proteiinidisulfidi-isomeraasi entsyymi, PDI
Endoplasmseen reticulumiin eli verkostoon liittyvä proteiinien hajoittaminen
Endoplasmiseen retikulumiin eli verkostoon liittyvä laaduntarkkailu
BiP
Hiiva

SECRETORY proteins are targeted to the ER of mammalian cells and are translocated into the ER lumen through a channel formed by the Sec61 protein complex (Andrews and Johnson, 1996; Hanein et al., 1996).
Eriteproteiinit kohdistetaan endoplasmiseen retikulumiin (ER) lämminveristen eläinten kehossa ja ne translokoituvat ER onteloon sellaista kanavaa myöten, jonka muodostaa proteiini nimeltä Sec61 kompleksi.

In the ER, secretory protein folding, covalent modification, and appropriate oligomerization are prerequisites for the packaging of these proteins into ER-to-Golgi complex transport vesicles (Hurtley and Helenius, 1989).
Endoplasmisessa verkossa on edellytyksiä näitten proteiinien hyvälle pakkaamiselle kuljetusrakkuloihin ER- GOLGIkompleksi järjestelmässä. Nämä edellytykset ovat että erittyvät proteiinit laskostuvat normaalisti, saavat kovalentin modifikaation ja asianmukaisen oligomerisaaation ( integroituvat erikseen isommasta alkutuotemassasta).

Misfolded secretory proteins are recognized by the quality control machinery in the ER and reexported to the cytosol in a Sec61p-dependent fashion, indicating that protein import and export across the ER membrane may be mediated by the same channel (Wiertz et al., 1996b; Pilon et al., 1997).
Väärin laskostuneet eritysproteiinit tunnistetaan laaduntarkkailujärjestelmällä, joka on ER:ssä ja ne kuljetetaan takaisin sytosoliin, solulimaan Sec61 kompleksista riippuvalla tavalla. Tämä viittaa siihen että sekä import että export, ER-koneistoon tuonti ja siitä ulosvienti välittyisi saman kanaalin kautta.

In the cytosol, misfolded secretory proteins are degraded by the proteasomes (Hiller et al., 1996; Werner et al., 1996; Wiertz et al., 1996a).
Sytosoliin palanneina väärin laskostautuneet protiinit hajoitetaan proteosomisilppurissa.


The mechanism of recognition of proteins destined for degradation is poorly understood (Cresswell and Hughes, 1997; Suzuki et al., 1998).
Proteiinisilppuriin kohdistettujen proteiinien tunnistusmekanismion heikosti tunnettua vielä vuonna 1999
Chaperones that facilitate protein folding in the ER are capable of distinguishing folded and unfolded proteins (Simons et al., 1995; Hendershot et al., 1996) and are, therefore, in a good position to recognize proteins as terminally misfolded and to target them for export from the ER.
Chpaeronit, jotka kiihdyttävät proteiinien laskostumista endoplasmisessa verkostossa , kykenevät erottamaan laskostetun ja laskostumattoman proteiinin ja sen takia ne ovat hyvällä paikalla tunnistamassa niitä proteiineja, jotka terminaalivaiheessa ovat viallisesti laskostuneita ja se voi kohdentaa niitä pois päin ER.stä

Using a cell-free assay that faithfully reproduces ER export and degradation of a mutant secretory protein, McCracken and Brodsky (1996) initially demonstrated that the ER chaperone calnexin is required for export.
Vuonna 1996 eräs tutkijaryhmä käytti solutonta tutkimusmenetelmää, jossa ER:stä uloskuljetus saatiin toistuvasti tapahtumaan samalla tavalla ja täten mutatoitunut eriteproteiini kohdistui silppuriin. Tässä tapahtumassa ER chaperonilla nimeltä calnexiini oli välttämätön osuus proteiinin poistamisessa ER- alueelta.

Lisäki osoitettiin 1999, että ER ontelon alueen chaperoni BiP-mutantti on myös osallisena viallisten eriteproteiinien takaisinkuljetuksessa hiivasn ER.stä.
In addition, the authors recently showed that mutations in the ER lumenal chaperone BiP also interfere with export of misfolded secretory proteins from the yeast ER (Brodsky et al., 1999).

PROTEIINIDISULDFIDI-ISOMERAASI on eräs tärkeä ER- alueen proteiini, jolla on monia funktioita.
Protein disulfide isomerase (PDI)1 is a major ER-resident protein with multiple functions (Gilbert, 1997).

As an enzyme, PDI catalyzes the formation and breakage of disulfide bonds (oxidoreductase) and rearranges preexisting disulfide bonds (isomerase; Gilbert, 1997).
Entsyymina PDI katalysoidisulfidisidosten(-S-S-) muodostusta ja katkeamista ( oxidoreduktaasi) ja se voi järjestää uudelleen olevaisia disulfidisiltoja.

Hiivassa PDI:llä on tärkeänä funktiona isomeraasitehtävät.
The isomerase activity of PDI is essential in the yeast Saccharomyces cerevisiae (Laboissiere et al., 1995).

Eräs tutkijaryhmä analysoi ihmisen PDI-entsyymin rakenteen ja ehdotti, että siinä on aktiivisia ja inaktiivisiua tioredoksiinimoduleita.
Kemmink et al. (1997) analyzed the domain structure of human PDI and suggested that it consists of active (a and a 9) and inactive (b and b 9) thioredoxin modules (Fig. 1 a).

Entsymaattisten tehtävien lisäksi lämminveristen PDI voi toimia chaperonina disulfidittomien, denaturoituneitten proteiinien uudelleen laskostamisessa (, mikä on nonentsymaattista chaperoni-aktiivisuutta) . Lisäksi PDI voi sitoutua peptideihin ER-ontelossa lämminverisillä ja hiivalla.

In addition to its enzymatic activities, mammalian PDI can chaperone the refolding of disulfide-free, denatured proteins in vitro (nonenzymatic chaperone activity; Gilbert, 1997), and both mammalian and yeast PDI can bind to peptides in the ER lumen (Welply et al., 1985; LaMantia et al., 1991; Klappa et al., 1997).

Recently, it has been shown that mammalian PDI also binds to secretory proteins late during protein translocation into the ER and that, like BiP, purified mammalian PDI has a higher affinity for unfolded than for correctly folded proteins, irrespective of their disulfide content (Klappa et al., 1995, 1997; Hendershot et al., 1996).

noin 1999 aíkoihin oli osoitettu että lämminveristen PDI myös sitoutue eriteproteiineihin myöhäisvaiheissa kun proteiineja translokoituu ER:n sisään ja kuten hiivachaperoni niin lämminveristen PDI omasi suuremman affiniteetin laskostumattomiin kuin korrektisti laskostuneisiin proteiineihin riippumatta niiden disulfidipitoisuudesta.


While wild-type PDI efficiently recognized this thiol-free misfolded protein, the PDI mutant proteins had a significantly lower affinity for this substrate.

Luonnollinen PDI tunnisti tehokkaasti tiolittomia väärinlaskostuneita proteiineja, mutta PDImutantti oli merkitsevästi heikompi afiiniteetiltaan niitä kohtaa

As a consequence, misfolded secretory proteins retained in the lumen of mutant microsomes remained associated with BiP.

Seurauksena oli, että väärinlaskostuneita eriteproteiineja pidättyi ER onteloon mutanttimikrosomeissa ja jäi kiinni chaperoniin ( hiivassa BiP chaperoniin).

In sec61 mutants deficient in retrograde transport from
the ER, a high proportion of misfolded secretory proteins was bound to PDI.

Jos oli kanaaliproteiinimutantti (sec61) retrogradinen kuljetus ei onnistunut ja väärinlaskostunut eriteproteiini jäi sitoutuneeksi PDI:chaperoniin.

We conclude that PDI is a component of the quality control machinery in the ER that recognizes misfolded proteins and targets them for export to the cytosol via the Sec61 channel.

Tästä johtopäätöksena tutkijat sanovat, että PDI on laaduntarkkailukoneiston osakomponentti kun endoplasmisessa retikulumissa tunnistuu väärinlaskostuneita proteiineja ja sitten niitä kohdistuu sytosoliin Sec61 kanavan kautta proteiinisilppuriin hajoitettavaksi. .