Väitöskirja: Abeta-peptidin uusi kvantitatiivinen mittaustekniikka. Täsmennystä diagnostiikkaan.

 Tänään 6.11. 2015  oli väitöstilaisuus Sahlgrenskan Akatemiassa. Sali oli täynnä. Väitös tapahtui englannin kielellä. Vastaväittäjänä  Andrew N. Hoofnagle, MD, Associate Professor. Department of Laboratory Medicine, University of Washington, Seattle, WA. USA.

Josef Pannee.  Mass spectrometric quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid and plasma- Implication for Alzheimer´s disease.

 ISBN 978-91-628-9487-0

Suomennosta abstraktista

Alzheimerin tauti (AD ) on tavallisin neurodegeneratiivinen tauti ikääntyneillä ja dementioista  sen osuus on 60-80%. Nykyvaiheessa AD-diagnoosi perustuu kognitiivisiin testeihin ja henkisen tilan tutkimuksiin, mutta  yhä useammin käytetään myös aivoselkäydinnesteen (CSF))  amyloidi-beta-peptidin  mittaamista  kliinisissä kokeissa ja  yhteyksissä. Monien proteiini- ja peptidi-biomerkitsijöiden kyseessä ollessa  kvantitatiivinen määrittäminen suoritetaan tavallisesti  vasta-aineisiin perustuvilla tekniikoilla kuten ELISA:lla. Kuitenkin näiden immunologisten menetelmien hankaluutena on Amyloidi-beta-pitoisuuksien mittauksissa havaitut  suuret vaihtelut, mikä haittaa sen käyttämistä diagnostisena merkitsijänä. 

Tämän väitöskirjan tarkoituksena oli kehitellä vasta-aineista riippumaton menetelmä, jolla voidaan kvantifioida absoluuttisesti   ihmisen aivoselkäydinnesteen Amyloidi-beta (mitata sen absoluuttinen määrä) ja jossa  ei tarvitse ottaa huomioon spesifisyys ja toistettavuusnäkökohtia, joita vasta-aineperusteiseen kvantifioimiseen liittyy. Metodi perustuu kiinteän faasin uuttamiseen (SPE) ja nestekromatografia (LC) - tandem mass spectrometry (MS/MS) -menetelmään.  Internaalisina standardeina käytettiin  stabiililla isotoopilla merkattuja Abeta- peptideitä, joiden avulla voitiin  mitata absoluuttiset määrät. Metodi on testattu piloottitutkimuksessa AD-potilaiden ja kontrollien aivoselkäydinnestenäytteistä. 

Kuten odotettiinkin oli AD potilaiden aivoselkäydinnesteen 42-aminohappoinen  Abeta-variantti (1-42), määrältään alentunut verrattuna  kontrolleihin.  Tulokset olivat samanlaisia, joita konventionellilla ELISA- menetelmällä on saatu,  ja vielä paremmin ryhmät saatiin  erottumaan toisistaan, kun käytettiin  suhdetta Abeta (1-42)/Abeta(1-40).

Sitten selvitettiin, antaisiko vasta-aineista riippumaton menetelmä samanlaisia tuloksia eri tutkimuskeskuksista ja aloitettiin laboratorioitten välinen tutkimus, mihin  sisällytettiin kolme laboratoriota, jotka käyttivät samaa LC-MS/MS-menetelmää. Tulokset osoittivat hyvää yhdenmukaisuutta ja vahvistettujen referenssimateriaalien (CRM)  tärkeys korostui, jolloin laboratorioitten ja MS-määristysten täsmääväisyys edelleen paranisi.  Metodia optimoitiin edelleen ja muokattiin päteväksi  ja sitten se  julkaistiin referenssin mittausprosessin (RMP)  kandidaattina . Tarvitaan tällaista RMP:tä  asetettaessa  arvo CRM:lle, jota taas käytetään "kultaisena standardina" harmonisoitaessa aivoselkäydinnesteen Abeta mittauksia.  

Sitten haluttiin selvittää, olisiko  ihmisen plasmassakin iso joukko Abeta- peptidejä niiden lisäksi, mitä aivoselkäydinnesteestä on löydettävissä,  nim. Abeta (1-38), Abeta (1-40) ja Abeta (1-42). Tähän tarkoitukseen kehiteltiin immunosaostukseen perustuva metodi, jolla voidaan rikastaa Abeta-peptidejä. (MALDI-TOF)MS- menetelmällä havaittiin  toistettavasti kuusitoista N- ja C-terminaalisesti lyhentyneitä Abeta-peptidejä. Vaikka   kvantitatiivinen määrittäminen  käyttämällä LC-MS/MS menetelmää peptideistä  Abeta (1-38), Abeta (1-40) ja Abeta (1-42) ei osoittanut  mitään liittymää AD-tautiin, metodi saattaisi kuitenkin olla hyödyllinen kliinisissä lääkeainekokeissa, jotka koskevat prekursoriproteiinin (APP) prosessoitumista tai Abeta-homeostaasia. 

Yhteenvetona: Abeta(1-42)-peptidin absoluuttisen määrän mitaaminen käyttämällä tätä kehiteltyä LC-MS-MS- metodia voidaan kiertää  ne ongelmat, joita liittyy vasta-aineisiin perustuviin menetelmiin. Tällä hetkellä metodia on pidettävä muodollisena vahvistuksena kuten referenssin mittausprosessina  (RMP) määriteltäessä Abeta(1-42) peptidin absoluuttista pitoisuutta vahvistetussa referenssimateriaalissa (CRM) harmonisoitaessa aivoselkäydinnesteen  Abeta (1-42)peptidin  mittatuksia eri tekniikoilla   ja analyyttisillä  ohjelmilla.