Väitöskirja: Abeta-peptidin uusi kvantitatiivinen mittaustekniikka. Täsmennystä diagnostiikkaan.

 Tänään 6.11. 2015  oli väitöstilaisuus Sahlgrenskan Akatemiassa. Sali oli täynnä. Väitös tapahtui englannin kielellä. Vastaväittäjänä  Andrew N. Hoofnagle, MD, Associate Professor. Department of Laboratory Medicine, University of Washington, Seattle, WA. USA.

Josef Pannee.  Mass spectrometric quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid and plasma- Implication for Alzheimer´s disease.

 ISBN 978-91-628-9487-0

Suomennosta abstraktista

Alzheimerin tauti (AD ) on tavallisin neurodegeneratiivinen tauti ikääntyneillä ja dementioista  sen osuus on 60-80%. Nykyvaiheessa AD-diagnoosi perustuu kognitiivisiin testeihin ja henkisen tilan tutkimuksiin, mutta  yhä useammin käytetään myös aivoselkäydinnesteen (CSF))  amyloidi-beta-peptidin  mittaamista  kliinisissä kokeissa ja  yhteyksissä. Monien proteiini- ja peptidi-biomerkitsijöiden kyseessä ollessa  kvantitatiivinen määrittäminen suoritetaan tavallisesti  vasta-aineisiin perustuvilla tekniikoilla kuten ELISA:lla. Kuitenkin näiden immunologisten menetelmien hankaluutena on Amyloidi-beta-pitoisuuksien mittauksissa havaitut  suuret vaihtelut, mikä haittaa sen käyttämistä diagnostisena merkitsijänä. 

Tämän väitöskirjan tarkoituksena oli kehitellä vasta-aineista riippumaton menetelmä, jolla voidaan kvantifioida absoluuttisesti   ihmisen aivoselkäydinnesteen Amyloidi-beta (mitata sen absoluuttinen määrä) ja jossa  ei tarvitse ottaa huomioon spesifisyys ja toistettavuusnäkökohtia, joita vasta-aineperusteiseen kvantifioimiseen liittyy. Metodi perustuu kiinteän faasin uuttamiseen (SPE) ja nestekromatografia (LC) - tandem mass spectrometry (MS/MS) -menetelmään.  Internaalisina standardeina käytettiin  stabiililla isotoopilla merkattuja Abeta- peptideitä, joiden avulla voitiin  mitata absoluuttiset määrät. Metodi on testattu piloottitutkimuksessa AD-potilaiden ja kontrollien aivoselkäydinnestenäytteistä. 

Kuten odotettiinkin oli AD potilaiden aivoselkäydinnesteen 42-aminohappoinen  Abeta-variantti (1-42), määrältään alentunut verrattuna  kontrolleihin.  Tulokset olivat samanlaisia, joita konventionellilla ELISA- menetelmällä on saatu,  ja vielä paremmin ryhmät saatiin  erottumaan toisistaan, kun käytettiin  suhdetta Abeta (1-42)/Abeta(1-40).

Sitten selvitettiin, antaisiko vasta-aineista riippumaton menetelmä samanlaisia tuloksia eri tutkimuskeskuksista ja aloitettiin laboratorioitten välinen tutkimus, mihin  sisällytettiin kolme laboratoriota, jotka käyttivät samaa LC-MS/MS-menetelmää. Tulokset osoittivat hyvää yhdenmukaisuutta ja vahvistettujen referenssimateriaalien (CRM)  tärkeys korostui, jolloin laboratorioitten ja MS-määristysten täsmääväisyys edelleen paranisi.  Metodia optimoitiin edelleen ja muokattiin päteväksi  ja sitten se  julkaistiin referenssin mittausprosessin (RMP)  kandidaattina . Tarvitaan tällaista RMP:tä  asetettaessa  arvo CRM:lle, jota taas käytetään "kultaisena standardina" harmonisoitaessa aivoselkäydinnesteen Abeta mittauksia.  

Sitten haluttiin selvittää, olisiko  ihmisen plasmassakin iso joukko Abeta- peptidejä niiden lisäksi, mitä aivoselkäydinnesteestä on löydettävissä,  nim. Abeta (1-38), Abeta (1-40) ja Abeta (1-42). Tähän tarkoitukseen kehiteltiin immunosaostukseen perustuva metodi, jolla voidaan rikastaa Abeta-peptidejä. (MALDI-TOF)MS- menetelmällä havaittiin  toistettavasti kuusitoista N- ja C-terminaalisesti lyhentyneitä Abeta-peptidejä. Vaikka   kvantitatiivinen määrittäminen  käyttämällä LC-MS/MS menetelmää peptideistä  Abeta (1-38), Abeta (1-40) ja Abeta (1-42) ei osoittanut  mitään liittymää AD-tautiin, metodi saattaisi kuitenkin olla hyödyllinen kliinisissä lääkeainekokeissa, jotka koskevat prekursoriproteiinin (APP) prosessoitumista tai Abeta-homeostaasia. 

Yhteenvetona: Abeta(1-42)-peptidin absoluuttisen määrän mitaaminen käyttämällä tätä kehiteltyä LC-MS-MS- metodia voidaan kiertää  ne ongelmat, joita liittyy vasta-aineisiin perustuviin menetelmiin. Tällä hetkellä metodia on pidettävä muodollisena vahvistuksena kuten referenssin mittausprosessina  (RMP) määriteltäessä Abeta(1-42) peptidin absoluuttista pitoisuutta vahvistetussa referenssimateriaalissa (CRM) harmonisoitaessa aivoselkäydinnesteen  Abeta (1-42)peptidin  mittatuksia eri tekniikoilla   ja analyyttisillä  ohjelmilla. 

Väitöskirja F Flood (2005) AD tautiin korreloivasta APP proteiinistä ja PS geeneistä. Normaalifunktiosta ja patologiasta

LÄHDE:
Flood Fiona: Alzheimers Disease Related Amyloid precursor protein  (APP) and presenilin Genes. Normal function and pathology (2005, KI, STH)
 ISBN 91-7140-050-8
http://www.avhandlingar.se/avhandling/bca0be90d4/

Kaikille jo tutun Alzheimerin taudin diagnosoi Tri Alois Alzheimer vuonna 1906. Sen jälkeen alettiin tietää, että taudissa kertyy aivoihin sulamatonta ja häviämätöntä materiaalia amyloidiplakkeja ja fibrillivyyhtejä. Aivojen tulisi voida suorittaa vapaasti remodelling uudistumistaan ja tällainen materiaali haittaa struktuurien aineenvaihdunnallista uusiutumista. Siten nämä johtavat taudin vääjäämättömään ja yksilön henkistä rakennetta luhistavaan kulkuun. Taudin vaikutusta henkiseen struktuuriin ihmisessä sanotaan dementiaksi. Varhain alkavat dementiat esiintyvät ennen 65 vuoden ikää ( EOAD, the Early Onset forms). Myöhemmät ovat LOAD, Late onset forms of AD.

• AD geeni taustaa

Geneettistä taustaa selvitellään- jatkuvasti ja uusia geenejä on alkanut löytyä. Geeneistä erityisesti kiinnostavia ovat APP ( Kang 1987) ja preseniliinigeenit (Scherrington 1995). Apolipoproteiini E (ApoE)-geeni on myös merkittävä, varsinkin sen alleeli epsilon 4. Lisäksi arvellaan olevan vielä tuntemattomia geeniä sekä polymorfismia altistamassa AD-taudille. LOAD geenin locuksia arvellaan olevan kromosomeissa 10 ja 12.

Kr.12:ssa  oleva LOAD-locus sisältää alfa-2 makroglobuliinigeenin ja LDLr-liittyvän geenin. Vielä yksi LOAD- locus on kromosomissa 19 (kr.19q13.2).(Siinä esiinthyvä PIN1 geeni palauttaa fosforyloitunutta tau-proteiinirakennetta ja siten estää parittaisten helikaalisten filamenttien muodostusta (PHF).

• Väitöskirja kertoo merkitsevistä tekijöistä mielenkiintoisesti

APP- proteiini on membraanissa sijaitseva I-tyypin glykoproteiini (gp), jolla on monta isoformia. Kaikkein eniten esiintyy niitä isoformeja, joissa on seuraavat määrät aminohappoja: 695, 751 ja 770 aminohappoa. APP on jäsen suuressa proteiiniperheessä jotka proteiinit ovat amyloidin edeltäjän kaltaisia (the amyloid precursor like proteins” (APLPs). APP esiintyy yleisesti kehossa. Sitä kypsyy endoplasmisessa retikulumissa ja Golgin laitteessa ja kulkeutuu plasmakalvoon. Kaksi pitempää APP isoformia sisältää KPI region (Kuniz protease inhibitor) ja niitä esiintyy ei-neuronaalisoluissa tavallisimmin. Tyyppiä APP695 on eniten hermosoluissa (Rohan 1995).

• APP geeni (Kr.21q21)

Abeetta-peptidin löytö neuriittiplakeista johti löytämään taustalla olevan geenin, joka koodasi tätä esiamyloidista proteiinia APP ( amyloid precursor protein) . APP geeni löytyi kromosomista 21 (21q21; Kang 1987). Kun se oli löydetty, sille löydettiin mutanttimuotoja. Nyt tunnetaan yhdeksän AD-tautia aiheuttavaa APP-geenin mutaatiota.(http://www.molgen.ua.ac.be/A/Dmutations ).

Useimat familiaalisen AD-taudin aiheuttavista mutaatioista sijaitsee lähellä Abeetta domaania ja johtavat Abeetta42 produktioon (Johnston 1994). Näitten kertymä ja sakkautuminen on alkuaskel AD-taudissa. 

Mutaation lisäksi saattaa samaa kertymää aiheuttaa APP-proteiinin liikaesiintymä sinänsä. (Tämän täytyy olla geenisäätöinen)

Downin oireyhtymässä sairastuu yksilöt noin 40 vuoden iässä helposti AD-tautiin. Tähän lie syy trisomiasssa, koska näin on ekstrakopio APP-geeniä olemassa. Extrakopion takia kehittyy ylimäärät Abeettaa (Tokuda 1997).

APP geeni on sellaisen promoottorin kontrolloma, josta puuttuu tavalliset TATA ja CAAT- tunnussekvenssit, joita yleensä eukarytoottisilla promoottoreilla esiintyy. Promoottori on GC-pitoista.  Transkription alkukohdasta ylävirtaan transkriptiotekijät SP-1 ja AP-1 pystyvät tunnistamaan promoottorin. Hiuspinnisilmukoitakin esiintyy. Geenisäätelyyn ilmeisesti osallistuu runsaasti tekijöitä.

Knock out- hiiri, jolta puuttuu APP geeni on pienehkö ja liikunnan aktiviteetti, lokomotioaktiviteetti on laskenut (Zheng 1996). Jos on ”Double knock” APP ja APLP2 puute, koe-eläin ei ole elinkykyinen tai sen tasapaino ja voimat jäävät kehittymättä (von Koch 1997).

 APLP2 muoto on fysiologisesti merkitsevin (Heber 2000).

• APP fysiologiset funktiot

Nämä lienevät seuraavat: neuronisolun sisäinen axonaalinen kuljetus, ( tämä on normaalisti  hyvin nopea tapahtuma ja  nopeuden  lasku tässä kuljetuksessa on kriittinen seikka);   neuriitin kasvu, migraatio ja elossapysyminen, synapsin muodostus, geenin säätely (Gunawardena 2001).

 Erittyvä normaali liukoinen sAPP voi omata osaa aikuisen neurogeneesissä. Se sitoutuu EGF-reagoiviin soluihin subventrikulaarisessa vyöhykkeessä aikuisaivossa. Progeniittorisolujen määrä voi nousta ja proliferaatio edistyy (Caille 2004).

• Preseniliinigeenin (PS1 ja PS2) löytyminen

On löydetty myös erään hyvin aggressivisen AD-taudin muoto ja sitä vastaava geenilocus paikallistettiin (1992 Schellenberg) kromosomiin 14. ( Kr14q24.3.).Tästä geenistä on havaittu olevan 111 erilaista AD-tautia aiheuttavaa mutaatiota. Geeniä merkitään preseniliini-1 geeniksi (PS1).

 Sen jälkeen löydettiin ykköskromosomista Kr.1q42.1 asemasta preseniliini-2 geeni (PS2). Näillä geeneillä  on sekvenssihomologiaa ( 67 %) . (Levey-Lahad 1995). Tällä geenillä on mutaatioita ainakin 10. PS-geenimuutatiot ovat usein penetroivia ja johtavat preseniiliin tautimuotoon (alle 65 vuotiailla). Mainitaan mutantti PS1 L166P, joka johtaa tautiin aikuisiässä.

• APP prosessoituminen eri kohdista pilkkovien sekretaasien avulla

Alfa-, beta- ja gamma-sekretaasit voivat pilkkoa APP-molekyylin osiin.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014579300020767

Normaali pilkkoutuminen

APP normaalisti pilkkoutuessaan antaa paloina ekstrasellulaarisen liukoisen NTF (sAPP) peptidin ja intrasellulaarinen CTF peptidin sekä p3 peptidin. Proteosomijärjestelmä osallistuu silppuroiman jätteitä. Normaalisti ei jää amyloidogeenistä peptidiä, sillä normaalit entsyymaattiset pilkkoutumiset eivät salli sen muodostua. Samalla on kalvorakenne myös pitänyt yllä ohuuttaan, eikä päinvastoin.

Hyvä kuva netistä joka esittää alternatiivit pilkkoutumistiet. Poimi APP:n normaalit pilkkoutumispätkät ja huomaa mitä kalvo on silloin kun normaalit pätkät siitä ovat poistuneet.

A-sekretaasiaktiivisuus välittyy disintegriinin ja metalloproteinaasien ADAM17/TNFalfakonvertoivan entsyymin (TACE) ja ADAM 10 kautta. Aivoissa esiintyy APP ja ADAM10 ko-ekspressiota, mutta ei ADAM 17. (Marcinkiewicz 2000).

• Amyloidipeptidi-jakso

APP proteiini omaa N extrasellulaarisen N-terminaalin, membraanin kautta kulkevan osan ja C-terminaalisen osan sytoplasmassa. Ns amyloidipeptidijakso sijaitsee osittain solun ulkopuolella ja osa siitä menee plasmamembraanin sisään. Jo vuosia sitten on tiedetty sen aminohappojärjestys ja se on seuraava. Tässä luetellaan N terminaalisista  44 aminohappoa., joista ainakin noin 32vasemmalla sijaitsee solun ulkoisesti ja loput solun kalvossa, solun kalvossa olevista mainitaan useita.

VKM/DAEFRHDSGY/EVHHQK/LVFFAEDVGSNKG/AIIGLMVGV/V/IAT/V/IVITL*VML

Alfapilkkoutuminen kohdistuu ekstrasellulääriseen osaan.
Katso tarkemmin :  http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014579300020767
Kohta on  viiden essentiellin (KLVFF)  aminohappojakson  lysiini ( K);  poikkiviiva , 

(Beta pilkkoutuminen BACE entsyymillä tapahtuu N-terminaalisesti).(poikkiviivat)

Gammapilkkoutuminen voi olla heterogeeninen, kohdistuu plasmakalvon sisässä olevaan osaan, jossa on hyvin runsaasti essentiellejä aminohappoja. , poikkiviivoja  niitten joukossa
 Abeetta 42 on ainakin kaksin verroin niin amyloidogeeninen kuin Abeetta 40- pituus.

Abeettapeptidinimensä pätkä saa kun sen N-terminaalipää on betasekretaasilla säilytetty tälle peptidille.

Alfa-sekretaasi

Kun peptidin pilkkominen alkaa, normaalitie on alfa-sekretaasitie, joka irrottaa extrasellulaarisen osan puolelta N-terminaalisen peptidiosan (NTF). ja siitä tulee  solubile N-terminal fragment, sAPP, liukoinen ja normaali.  Nyt on vielä  A  tynkää kiinni kalvossa ja solun sisällä  on  C-terminaali siinä kiinni.

Sitten toimii gamma-sekretaasi normaalisti

Se irrottaa proteolyyttisesti pilkkomalla  kalvossa olevan A peptidin   jostain kohdasta, ( jossa on paljon  essentiellejä valiineja (V)  ja muita ess. aminohappoja.)    siten , että C-terminaalinen osa (AICD) vapautuu solun sisään  ja solusta  irtoaa ns.p3 peptidi, pieni, joka ei ole amyloidogeeninen, sillä molemmat päät on sopivan tarkasti pilkottu. Tästä p3 palasta ei ole haittaa, mutta sillä voi olla oma normaalifunktio, se menee extrasellulaaritilaan .

Kun sytoplasman puolelle oli jäänyt AICD  (  APP:n intracellulaarinen domaani)  eli    CTF ( C-terminaalinen fragmentti se lie  83 aminohappoa pitkä 

Tämä on ei- amyloidogeeninen pilkkoutuminen.

 Tätä alfa ja gammasekretaasin yhteistyötä stimuloi AK-erginen hermojärjestelmä M1 ja M3 reseptorien välityksellä,  sekä PKC-entsyymivälitteinen järjestelmä.

APP ja AICD, APLP ja ICDs

APP pilkkoutuu normaalisti gamma-sekretaasilla epsilon kohdasta *kalvoseinämän sisällä, jolloin ”intrasellulaarinen domaani- AICD”  (APP intracellulaarinen domaani). irtoa sytoplasmaan.  Se voi osallistua transkriptionaaliseen säätelyyn (Notchin tapaan?)  (Cao 2001).
(AICD voi tehdä kompleksin nukleaarisen adaptoriproteiinin Fe ja histoniasetyltransferasin Tip60 kanssa stimuloiden transkriptiota solutason tutkimuksissa).
 AICD:n täytyy sitten päästää Fe65 irti ja itse hajota edelleen. Fe65 on transkriptiotekijä.

Samoin APLP1 ja APLP2 voivat tuottaa ICD, jotka sitoutuvat Fe65:een ja voivat translokoitua tumaan ja osallistua transkriptioon.

Pitkät APP-muodot, joissa on KPI jakso, voivat osallistua hyytymiskaskadiin, koska KPI on seriiniproteaasin inhibiittori. Aivoissa ei tätä kuitenkaan ilmentynyt paljoakaan.

• Beta-sekretaasi (BACE)  ja sitten preseniliini (PS)

MUTTA jostain syystä tämä järjestelmä ei pysty käsittelemään kaikkea APP proteiinia,  ja toinen entsyymikombinaatio alkaa toimia: Beta-sekretaasi (BACE) pilkkoo suoraan amyloidogeenisen pro- peptidin N-terminaalipäästä siten, että C- terminaali, CTF on 99 aminohappoa sisältäen vielä koko amyloidogeenisen peptidijakson  Sitten gammasekretaasi epätarkasti sohaisten C-terminaalipäästä tuottaa heterogeenistä amyloidipeptidiä. erikokoisia Abeeta peptidejä. Amyloidipeptidi on 39-43 aminohapon pituinen. Näistä 42- pituus on varsin amyloidigeeninen .

BACE:n lisäksi on havaittu että preseniliini voi vaikuttaa gammasekretaasifunktioon tai ilman gammasekretaasiakin.

Epsilonkohdaksi sanotaan aminohappojen leusiini 49 ja valiini 50 välistä kohtaa, josta voi tapahtua pilkkoutuminen.(Weidemann 2002). Tämä kohta on jo lähellä plasmamembraanin sisäpintaa ja voi aiheuttaa, että pilkkoutumistuotteet AICD joutuvat sytoplasman puolelle.

Tässä puolestani kommentoin:

Se peptidipätkä, johon preseniliini helposti aiheuttaa pilkkouman on essentiellien aminohappoje sekvenssi. Siin on kokonaista 10 aminohappoa, jotka voidaan saada vain hyvästä ravinnosta. Voisi melkein sanoa, että siinä voi olla ”aukko”.Tai ainakin locus minor resistentiae. Voihan  olla energia ja ravitsemustilan heijastumaakin, että kaikenlaista amyloidimassaa kertyy.

Preseniliinistä ja PS1 ja PS2 geenistä

Preseniliinin geenit PS1 ja PS 2 koodavat homologisia proteiineja, joita on kautta kehon, eniten aivoissa ja siellä neuroneissa. Molekyyliä näyttää esiintyvät kautta solun eri osissa, jopa tumassa, tumakalvossa, soluliman mikro-organismeissa ja solukalvossa ja sytoplasmassa, joten sillä lie useita sellulaarisia tehtäviä.

PS1- geenillä on normaali promoottori CAAT, ”heat shock responsive element”, ”polyomavirus enhancer active-3 site”, Ets-1-3 site, monta SP1 kohtaa ja AP2 kohtaa ja CREB sitova kohta.

PS2- geenillä on edellisestä consensuksesta vain multippelit SP1 ja AP2 kohdat. Preseniliini 1 on 467 aminohappoa ja preseniliini 448 aminohappoa. Ne ovat transmembraaniproteiineja, kahdeksan TM domaania ja sytoplasmalenkki 6-7 domaanivälissä. Holoproteiini 44 kDa pilkkoutuu: Lenkin kohta pilkkoutuu ER:ssä muodostaen kaksi derivaattaa NTF 27 kDa ja CTF 17 kDa. Ne muodostavat stabiilin heterodimeerin, joka on biologisesti aktiivi ja sen puoliintumisaika yli 24 tuntia. Ylimäärä holoproteiinia menee proteosomisilppuriin. Heterodimeeri muodostaa massiivisen korkeamolekulaarisen kompleksin joka kasvaa aktiivisuudessa ja on 220-250 kDa.

Familiaalisen AD taudin PS1 mutaatiot ovat osoittautuneet olevan N-terminaalisessa fragmentissa. PS1 geenin puuttuma on letaali. 
 PS2 geenin puuttuma johtaa lievään kehkofibroosiin ja hemorrhagioihin koe-eläimellä. Postnataalisesti aiheutettu PS1 ja PS2 –knock out hiiressä aiheuttaa synaptisissa NMDA-reseptoreissa ja niiden vasteissa alenemista, lisksi kortikaalista neurodegeneraatiota, aivokammioitten laajenemaa, muistin ja synaptifunktion vikuuntumista. Samalla havaittiin tau-hyperfosforylaatiota, kaspaasiapoptoosia ja neuronaalista atrofiaa.

• Yhteenvetona tutkijan tarkoituksista

F Flood  selvitteli APP ja PS-geenien normaalia funktiota ja patofysiologiaa ihmisaivojen alueella. Iän lisääntyminen on suurin riskitekijä sporadisissa AD-taudeissa. Lisääntynyt APP expressio taas esim Downin syndroomassa oli tautiin johtavaa. Lisäksi proteosomisilppurin toiminnan inhibitio voisi olla amyloidogeneesin takana. Ei-amyloidogeenisen APP-pilkkoutumisen osuus on tärkeä ja sitä tietä normalisoimalla voi estää AD- muutoksia. Tutkija selvittää amyloidogeenisen ja ei-amyloidogeenisen APP-proteiinin pilkkoutumisen solussa ja kertoo siinä tarvittavista sekretaasi-entsyymeistä ja niiden vaikutuskohdista. Samalla hän selvittää PS ja APP-geenituotteiden varsinaista normaalia funktiota ja tärkeyttä, tarpeellisuutta. Hän tutkii (I )  AD-linkkiytyneitten geenien kortikaalista expressiota ja ikämuutoksia ja suhdetta taudinkuvaan. (Geenit. APP, APPKPI, APLP2, PS1). (II) Tutkija määrittelee miten eri geeniannoksella aiheutetut APP ekspressiot vaikuttavat basaaliseen tai PKC-stimuloituun APP-eritykseen. (III) Erityistutkimuksia mutanttigeeneistä. (IV) Tutkija selvitti preseniliiniproteiinien osuutta neuronaalisessa differentiaatiossa. (V) Normaalin iän mukana proteosomisilppuritoiminta inhiboituu. Tutkija katsoi, onko sillä merkitystä gammasekretaasitien kautta pilkkoutuviin APP proteiineihin. Hän myös katsoi caspaasi-3 entsyymin (apoptoosia aktivoivan proteiinin) osuutta asiassa. Väitöskirja antaa tuoretta tietoa AD taudin taustatekijöiden tutkimuksen nykyisestä vaiheesta ja selventää monia yksityisiä osatekijöitä, joihin tässä suomennoksessa on vain viitattu lyhyesti.

Suositeltavaa luettavaa! kun tiede popularisoituu ja tietämys rakenneproteiinien ja ihmisen syömän biologisesti korkealaatuisen proteiini ja  tarvetta vastaavan energiaravinnon assosiaatiosta keskenään lisääntyy, voidaan vaikuttaa aivojen struktuuriin paremmin.

10 februari 2005 19:38

Päivitystä 18. 9.2010.
Päivitystä 29.5. 2015

Muistin perusmuodostumisesta uusi väitöskirja (LTP)

VÄITÖSKIRJA, jossa on alettu arvioida ja punnita uudelleen LTP-teoriaa muistiaineksen  indusoitumisesta, konsolidoitumisesta ja stabiloitumsesta ja  suhteesta protiinisynteesiin   muistin  keskisessä  aivorakenteessa hippokampissa.  Abbas, Abdul-Karim Re-evaluation of the hypothesis that LTP has two temporal phases and that the late phase is protein synthesis-dependent

19-feb-2015

University of Gothenburg. Sahlgrenska Academy

Institute of Neuroscience and Physiology. Department of Physiology

I. Abbas, Abdul-Karim, Dozmorov, Mikhail, Li, Rui, Huang, Fen-Sheng, Hellberg, Fredrik, Danielson, Jonas, Tian, Ye, Ekström, Jörgen, Sandberg, Mats, Wigström, Holger. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neuroscience Research 2007 Jan;63(1):59-65. VISA ARTIKEL II. Abbas, Abdul-Karim, Huang, Fen-Sheng, Li, Rui, Ekström, Jörgen, Wigström, Holger. Emetine treatment masks initial LTP without affecting long-term stability. Brain Research 2011 Dec 2;1426:18-29. VISA ARTIKEL III. Abbas, Abdul-Karim. Evidence for constitutive protein synthesis in hippocampal LTP stabilization. Neuroscience 2013 Aug 29;246:301-11. VISA ARTIKEL IV. Abbas, Abdul-Karim, Villers, Agnés, Ris, Laurence. Temporal phases of Long-term potentiation (LTP): myth or fact? Review in the Neurosciences 2015 (In Press).

978-91-628-9302-6

http://hdl.handle.net/2077/37535

Abstraktin suomennos:

• Muistiainekertymän pitkäaikaispotentioituminen (LTP) on aktiivisuudesta riippuvaa lisääntymistä synaptisessa tehossa- ja tätä on eniten tutkittu hippokampista ja sitä on pidetty solusubstraattina, joka vastaa oppimista ja muistia.
   Jos uskotaan, että LTP:n ajallinen kestävyys on analogista hippokampista riippuvan muistimateriaalin pitkäaikaispysymiselle, tulee välttämättömäksi ymmärtää LTP:n stabilisoitumisen taustalla olevat mekanismiit.
  

Long-term potentiation (LTP) is an activity-dependent increase in synaptic efficacy that is most studied in the hippocampus and that is considered a cellular substrate for learning and memory. Accepting the belief that the durability (persistence in time) of LTP is analogical to long-standing store of hippocampus-dependent memories warrants the necessity for understanding the mechanisms underlying LTP stabilization.

• Vaikka suurin osa neurologian alan tiedemiehistä olettaakin, että LTP-induktio, muistinmuodostuminen,  liipaisee esiin valkuaisainesynteesiä, joka toimii välineenä muistiaineksen jatkokonsolidoitumisessa, ei kuitenkaan ole selvä asia sellaisten oletettujen proteiinien olemassaolokaan eikä mekanismi, jolla ne vaikuttaisivat LTP:n konsolidoitumisen.
  

Although the great majority of neuroscientists assume that LTP induction, akin to the formation of memories triggers the synthesis of proteins that are instrumental for subsequent consolidation neither the identity of such presumed proteins nor the mechanisms by which they act to consolidate LTP are clear.

• Tähän ajatteluun perustuen on LTP:ssä tapana ajallisesti  erottaa  varhaisvaihe, varhainen LTP ( early , E-LTP), mikä katsotaan proteiinisynteesistä riippumattomaksi sekä myöhäisvaihe ( late, L-LTP) , joka taas on katsottu  proteiinisynteesistä riippuvaiseksi. Kuitenkin useat behavioristiset ja elektrofysiologiset löydöt herättävät epäilyjä täman käsityksen oikeudesta.
  

Based on this notion LTP is distinguished temporally into an early phase (E-LTP), which is protein synthesis-independent and a late phase (L-LTP), which is protein synthesis-dependent. However, several behavioral and electrophysiological findings cast doubts on this notion.

• Tässä käsilläolevassa väitöskirjassa tutkija on selvittänyt proteiinisynteesin estäjien (PSI) vaikutusta LTP:n stabiloitumiseen hippokampileikkeissä, joita oli valmistettu nuorilta koe-eläimiltä. He käsittelivät leikkeet proteiinisynteesi-inhibiittoreilla (PSI) ja tutkivat niitä siitä aikaikkunasta, mikä vastaa sellaista LTP:n indusoitumisvaihetta, mitä kirjallisuudessa on aiemminkin käytetty, ja he havaitsivat, että proteiinsynteesinestäjät (PSI) eivät pystyneetkään blokeeraamaan myöhäistä LTP-vaihetta (L-LTP), mikä tulos taas oli ristiriidassa aiemmin julkaistun tiedon kanssa.
  

In the present thesis I have examined the effect of protein synthesis inhibitors (PSIs) on the stabilization of LTP in hippocampal slices obtained from young rats. Treating hippocampal slices with PSIs using a temporal window relative to the induction of LTP that has previously been used in the literature failed to block L-LTP, a result in contrast with published data.

• Kuitenkin esikäsittely pitkäaikaisesti vaikuttavalla PSI -aineella emetiinillä pystyi blokeeraamaan LTP:n LTP:hen korreloitumattomalla mekanismilla, koska aine osoitti huonontavaa tehoa perustason vasteeseen. Ja päinvastoin – jos proteiinikirjoa hippokampileikkeestä oli poistettu pitkäkestoisella PSI-esikäsittelyllä käyttäen sykloheximidi-nimistä ainetta, LTP:n stabiloituminen huononi.
  

However, long-lasting pretreatment with the PSI emetine blocked LTP by LTP-unrelated mechanism as the drug showed deteriorating effect on the baseline response. In contrast, depleting the protein repertoire in the slice by long-lasting pretreatment with the PSI cycloheximide deteriorated the stabilization of LTP.

• Lisäksi proteiinien hajoamisen kiihdyttäminen käyttämällä vetyperoksidia LTP:n induktion jälkeen johti LTP:n häviämiseen. Sykloheximidin lisääminen indusoi LTP:n stabiloitumisessa edelleen huononemista. Nämä ristiriitaiset löydöt on äskettäinn toistettu useissa laboratorioissa.
  

Additionally, acceleration of protein degradation using hydrogen peroxide after the induction of LTP resulted in decay of LTP. Addition of cycloheximide induced additive decay of LTP stabilization. These contradictory findings have recently been replicated by other laboratories.

• Tässä väitöskirjassaan tutkija esittää oman työmallinsa, jonka tarkoituksena on selittää näitä ristiriitaisia löytöjä proteiininsynteesinestäjistä (PSI) ja LTP.stä. Mallissa myönnetään, että proteiinien turnover-prosessin kinetiikan tunteminen LTP:n indusoitumisen ajalta saattaa antaa ennusteen LTP:n jatkostabilisoitumisesta. Tämä voisi selittää sen suureen vaihtelevaisuuden, mitä ilmenee proteiinisynteesistä oletetusti  riippumattoman E-LTP - vaiheen ajallisessa kestossa.
  
• Tämä malli saa tukea sellaisistakin kokeista, joissa käytettiin erään proteosomi-inhibiittorin (MG-115) matalaa pitoisuutta kohentamaan heikolla induktiolla indusoidun LTP:n stabiliteettia.
  

In this thesis I present a working model that aims to explain the discrepant findings regarding PSI and LTP. The model concedes that knowing the kinetics of protein turnover during the induction of LTP may provide a prediction for the subsequent stabilization of LTP.
This can explain the wide variability in the time course of the presumed protein-synthesis independent E-LTP. The model gains support from experiments in which a low concentration of the proteasome inhibitor MG-115 improved the stability of LTP induced by a weak induction protocol.

• Yhteenvetona väitöskirjan tekija mainitsee tulostensa viittaavan siihen , että (1) on virheellistä dikotomiaa jakaa LTP ajallisesti varhaiseen (E-LTP) ja myöhäiseen (L-LTP) faasiin ja että (2) proteiinin hajoamistahdilla voitaisiin selvittää, pystyykö proteiininsynteesin estäjät vaikuttamaan jotakin LTP:n stabilisoitumiseen vai eivätkö pysty.

In summary, my results suggest that 1) the temporal distinction of LTP into E- and L-LTP is a false dichotomy and 2) the rate of protein degradation may explain whether PSIs would, or would not, have an effect on LTP stabilization.

Suomennos  abstraktista 28.2. 2015. Väitöstilaisuus on edessäpäin Göteborgin Yliopiston Sahlgrenskan Akatemiassa.